Abigaille ha in mano uno scritto, sottratto a Nabucco, nel quale scopre le sue origini servili.
Per questa ragione Nabucco destina il trono alla figlia minore, Fenena, mentre Abigaille è tenuta in schiavitù.
Questa sua condizione la rende furente contro tutti, al punto da minacciare di morte Fenena, il finto padre Nabucco e il regno.
Il gran sacerdote di Belo avverte Abigaille che Fenena sta liberando gli Ebrei, per cui il popolo assiro acclama regina Abigaille.
Nella reggia Ismaele incontra i Leviti che gli intimano di fuggire, maledicendolo perché ha tradito il suo popolo. Sopraggiunge Anna, che dice di aver pietà di Ismaele: ha salvato un’ebrea, Fenena, che si è infatti convertita al dio di Israele.
Entra Abdallo dicendo che è stata annunciata la morte di Nabucco e che Abigaille è invocata regina.
Abigaille intima a Fenena di renderle la corona; ma entra Nabucco e, strappata la corona dalle mani di Abigaille, la sfida a prenderla dal suo capo.
Nabucco ripudia il dio di Babilonia, che ha reso i babilonesi traditori, e quello degli Ebrei, che li ha posti in suo potere e, in un impeto d’orgoglio, dichiara se stesso dio. A questa affermazione viene colpito da un fulmine e Nabucco sembra avere sul volto le tracce della follia: sconvolto, cade, invocando l’aiuto di Fenena, mentre Abigaille raccoglie la corona.